線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1） C0008

 

描述：研究表明線粒體與細胞凋亡密切相關，其中線粒體跨膜電位（△ψ）的破壞，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件之一，它發生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、DNA 斷裂） 出現之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。

試劑盒采用 JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)一種陽離子脂質熒光染料作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1 有單體和多聚體兩種存在狀態，在低濃度時以單體形式存在，高濃度時以多聚體形式存在，兩者的發射光譜不同，但均可在流式細胞儀綠色（FL-1）通道檢測出綠色熒光，JC-1 可透過正常細胞 膜以單體狀態聚集胞內，正常健康線粒體的膜電位（△ψ）具有極性，JC-1 依賴于△ψ的極性被迅速攝入線粒體內，并因濃度增高而在線粒體內形成多聚體，多聚體發射光為紅色熒光；可被流式細胞儀的紅色（FL-2）通道檢測到，而細胞發生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1 從線粒體內釋放，紅光強度減弱，以單體的形式存在于胞質內發綠色熒光。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化。

 

適用范圍：可應用于細胞、組織或純化的線粒體膜電位檢測

 

規格及儲存： JC-1        50μL     -20℃ 避光保存  一年有效

10×Incubation Buffer     10ml   4℃保存  一年有效

 

需要用到的儀器和其他試劑：流式細胞儀或熒光顯微鏡、高速離心機、CO2 培養箱、微量移液器

1.5ml Microtube、載玻片、蓋玻片（熒光顯微鏡觀察需用）、PBS、滅菌去離子水

 

 

操作步驟：

1.         用適當的方法誘導細胞凋亡，設立陰性對照組和陽性對照組【用適當的凋亡誘導劑（如星形孢菌素，staurosporine），誘導適當時間后經其它檢測（如 AnnexinV 或Caspase3 活性）證實確有凋亡產生】，收集細胞；

2.         JC-1 工作液的配置：取 2μL JC-1（500×），加入 900μL 滅菌去離子水中，劇烈渦旋充分溶解并混勻 JC-1。加入 100μL 10×Incubation Buffer，混勻后即為 1 mL JC-1 工作液。

注：細胞懸液每 50-100 萬細胞大概需 500 μL JC-1 工作液。六孔板每孔需要 1mL 的 JC-1 工作液，

其它培養器皿的 JC-1 工作液的用量以此類推；

3.         1×Incubation Buffer  的配置：取 100μL 10×Incubation Buffer 加 900μL 滅菌去離子水稀釋成 1

×Incubation Buffer，混勻并預熱至 37℃備用； 懸浮細胞

1.   取 1×10⁵ ~10⁶ 細胞，用PBS 洗滌細胞二次（離心 2000rpm5min）；

2.   取 500μL JC-1 工作液將細胞均勻懸浮，37℃，5%CO² 的培養箱中孵育 15~20min；

3.   室溫離心（2000rpm，5min）收集細胞，用 1×Incubation Buffer 洗兩次：加入 1mL 1× Incubation Buffer 重懸細胞，離心收集細胞，再次加入 1mL 1×Incubation Buffer 重懸細胞，離心收集細胞；

4.   吸取 500μL 1×Incubation Buffer 重新懸浮細胞；5. 熒光顯微鏡觀察、熒光酶標儀或流式細胞儀分析。

貼壁細胞

（希望采用熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，建議先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法）

1.   對于六孔板，吸除培養液，用 PBS 洗滌細胞一次；

2.   加入 1mL JC-1 工作液，將細胞均勻覆蓋，37℃，5%CO² 的培養箱中孵育 15~20min；

3.   吸除上清，用 1×Incubation Buffer 洗兩次；

4.   加入 1-2 mL 細胞培養液(可含血清和酚紅)；

5.   熒光顯微鏡觀察或激光共聚焦拍照分析。純化的線粒體

1.   把配置好的 JC-1 工作液用 1×Incubation Buffer 稀釋 5 倍；

2.   向 900μL 稀釋后的 JC-1 工作液中加入 100μL 總蛋白量為 10-100 ug 的純化的線粒體，37℃，

5%CO² 的培養箱中孵育 10~20min；

3.   熒光顯微鏡觀察、激光共聚焦拍照或熒光酶標儀分析。

A.   熒光顯微鏡觀察

檢測 JC-1 單體時可以把激發光設置為 490nm，發射光設置為 530nm；檢測 JC-1 聚合物時， 可以把激發光設置為 525nm，發射光設置為 590nm。

注意：此處測定熒光時不必把激發光和發射光設置在最大激發波長和最大發射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-1 單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設置，如GFP 或 FITC 時的設置；檢測 JC-1 聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或 Cy3 時的設置。出現綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態也比較正常。

 

正常細胞：雙色濾光片觀察則為：綠++ 紅++（高綠高紅），在同一濾光片下觀察則為黃綠色凋亡細胞：雙色濾光片觀察則為：綠++ 紅+（高綠低紅）， 如在同一濾光片下觀察則為綠色

 

B.   流式細胞儀分析

用流式細胞儀檢測（Ex=488 nm; Em=530 nm）細胞凋亡的情況，綠色熒光通過 FITC 通道通常為 FL1 來檢測；紅色熒光通過PI 通道通常為 FL2 來檢測。

正常細胞{FL-1 亮,FL-2 亮; R1}，凋亡細胞 {FL-1 亮, FL-2 暗; R2}，設門的位置根椐細胞種