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活性氧檢測試劑盒   (Reactive Oxygen Species Assay Kit)  C1300

 

描述：活性氧包括超氧自由基（O₂?^?）、過氧化氫（H₂O₂）、羥基自由基（?OH）、過氧亞硝基（ONOO^?）、一氧化氮（?NO）等，它們參與了細胞增殖生長、發育分化、衰老和凋亡等許多生理和病理過程。   試劑盒采用DCFH-DA (2,7-dichlorofluorescin diacetate)探針方法，是迄今最常用、最靈敏的細胞內活性氧檢測探針。DCFH-DA沒有熒光，進入細胞后可以被酯酶水解為不能透過細胞 膜的DCFH（dichlorofluorescin），當活性氧存在時，DCFH被氧化為強綠色熒光物質DCF（dichlorofluorescein），熒光在激發波長502 nm，發射波長530 nm附近有最大波峰，熒光水平與細胞內活性氧水平成正比。本試劑盒提供的活性氧檢測系統本底水平低，靈敏度高，重復性好，操作簡便。

適用范圍：貼壁細胞、懸浮細胞、新鮮動物組織

工作波長：最佳激發波長500（500 ± 15 nm），最佳發射波長525 (530 ± 20 nm)。也可按照FITC熒光檢測條件檢測。

組成： (1)  0.1 ml, 10 mM DCFH-DA，-20 oC避光保存  一年有效

(2)  1 ml活性氧供體，-20oC避光保存  一年有效

所需設備：流式細胞儀、熒光酶標儀、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計等

操作步驟：

一、細胞樣本：

1.         收集細胞，進行活性氧測定

1.1 細胞收集：懸浮細胞：2000rpm，離心5min，收集沉淀，用0.01M PBS或無血清培養液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細胞沉淀；貼壁細胞：吸去培養液，用0.01M PBS或無血清培養液反復吹打，使細胞層全部進入PBS或培養液中，收集細胞懸液，用0.01M PBS或無血清培養液洗滌2次，1000rpm，離心5min，棄上清，取細胞沉淀；

1.2加入DCFH-DA探針，同時設置陰性對照、陽性對照管

樣本管：用稀釋好的DCFH-DA熒光探針重懸細胞沉淀，一般情況下，細胞密度要求1*10⁶-2*10⁷/ml，推薦探針初始工作濃度為10 μM（DCFH-DA工作濃度可在100 nM~20 μM范圍內，這需進行預實驗確定最適濃度）。

陰性對照：不加探針，只加入PBS或培養基的細胞。

陽性對照：已加入DCFH-DA熒光探針，并加入活性氧供體的細胞懸液，推薦試劑工作濃度20-100 μM。

1.3 37 oC孵育細胞30分鐘~幾個小時。通常情況下，30-60分鐘即可。注意：孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、DCFH-DA濃度等有關。可以每隔5min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

1.4 1000g，離心5min，去上清收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細胞。

1.5 進行熒光檢測，以熒光度數值表示結果。

 

2. 不收集細胞，直接將探針加入培養基測定

2.1加入DCFH-DA探針，同時設置陰性對照、陽性對照管

樣本管：去除細胞培養基上清，加入用無血清培養液稀釋好的DCFH-DA探針（推薦探針終濃度為10 μM），加入探針的體積以能蓋住細胞為宜，通常6孔板單孔不少于1ml。

陰性對照：不加探針，只加入培養基的細胞。

陽性對照：已加入DCFH-DA熒光探針，并加入活性氧供體的細胞，推薦試劑工作濃度20-100 μM。

2.2 37 oC孵育細胞30分鐘~幾個小時。通常情況下，30-60分鐘即可。注意：孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、DCFH-DA濃度等有關。可以每隔5min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

2.3 棄去上層培養液，用無血清培養液或0.01M PBS反復吹打，使細胞層全部進入PBS或培養液中。

2.4收集細胞懸液，用0.01M PBS或無血清培養液洗滌2次，去除未進入細胞內的探針，1000rpm，離心5min，棄上清，收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細胞。

2.5進行熒光檢測，以熒光度數值表示結果。

 

二、 動物組織樣本

1.1細胞懸液制備：可采用單細胞懸液制備儀或傳統的組織處理方法如：酶解法、研磨法等制備單細胞懸液；

1.2加入DCFH-DA探針，同時設置陰性對照、陽性對照管

樣本管：用稀釋好的DCFH-DA熒光探針重懸細胞沉淀，一般情況下，細胞密度要求1*10⁶-2*10⁷/ml，推薦探針初始工作濃度為10 μM（DCFH-DA工作濃度可在100 nM~20 μM范圍內，這需進行預實驗確定最適濃度）。

陰性對照：不加探針，只用0.01M PBS重懸的細胞。

陽性對照： 已加入DCFH-DA熒光探針，并加入活性氧供體的細胞懸液，推薦試劑工作濃度20-100 μM。

1.3 37 oC孵育細胞30分鐘~幾個小時。通常情況下，30-60分鐘即可。注意：孵育時間長短與細胞類型、刺激條件、DCFH-DA濃度等有關。可以每隔5min顛倒混勻一下，使探針與樣本充分接觸。

1.4 1000g，離心5min，去上清收集細胞沉淀，用PBS緩沖液洗滌2次，重懸細胞

1.5 進行熒光檢測，以熒光度數值表示結果。

 

注意事項：

1. 本試劑盒特別適用于貼壁細胞和懸浮細胞活性氧的檢測。對于動物組織樣本而言，應盡量選擇新鮮組織，勻漿操作應盡量快速，以減少實驗誤差，如果樣本已經凍存，則無法保證檢測結果的可靠性。

2. DCFH-DA可稀釋于培養基或緩沖液中。血清或培養基的顏色并不會影響DCFH-DA及細胞內熒光的產生，但可能會影響熒光顯微鏡觀察，干擾熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀的熒光測定。如果用上述儀器進行測定時，可將DCFH-DA稀釋于無酚紅培養基或適宜的緩沖液如PBS中。

3. 加入DCFH-DA的時機和孵育時間，以最終能順利檢測細胞內活性氧為目的。當細胞藥物處理時間較短(如<2 小時)或預計ROS效應較弱時，可將DCFH-DA在藥物處理之前或者與藥物同時加入到細胞培養基中；反之，當藥物處理時間較長(如>6小時)或預計產生ROS效應較強時，可將DCFH-DA在藥物處理之后再加入。

4. 活性氧供體內含高純度12 mM 的H₂O₂。加入細胞后可使DCFH-DA氧化為DCF呈現強綠色熒光。推薦該試劑的細胞工作濃度為20-100 μM或更低濃度，當其濃度超過200μM時，將產生細胞毒性。如果用戶熟悉ROS熒光或實驗沒有必要采用陽性對照，可以不加該試劑。一般情況下，活性氧供體加入到細胞30min左右即可產生明顯的綠色熒光。

 

 

以下僅僅列舉部分使用北京普利萊基因技術公司活性氧檢測試劑盒發表的SCI研究論文：

1. Liu Xin, Sun Jiao, 2010. Endothelial cells dysfunction induced by silica nanoparticles through oxidative stress via JNK/P53 and NF-κB pathways. Biomaterials, 31(32): 8198-8209. 

 

2. Yuan Shaopeng, Fu Yan, Wang Xiaofeng, Shi Hubing, Huang Yujie, Song Xiaomin, Li Ling, Song Nan, Luo Yongzhang, 2008. Voltage-dependent anion channel 1 is involved in endostatin-induced endothelial cell apoptosis. The FASEB Journal, 22: 2809-2820.    

 

3. Deng Sanming, Yang Ye, Han Yong, Li Xiaofei, Wang Xiaoping, Li Xueyong, Zhang Zhipei, Wang Yunjie, 2012. UCP2 Inhibits ROS-Mediated Apoptosis in A549 under Hypoxic Conditions. PLoS ONE, 7(1): e30714. doi:10.1371/journal.pone.0030714. 

 

4. Zhuo Wei, Song Xiaomin, Zhou Hao, Luo Yongzhang, 2011. Arginine deiminase modulates endothelial tip cells via excessive synthesis of reactive oxygen species. Biochemical Society Transactions, 39: 1376-1381.     

 

5. Yue Yang, Zhou Huafeng, Liu Guanlan, Li Yan, Yan Zemin, Duan Mingxing, 2010. The advantages of a novel CoQ10 delivery system in skin photo-protection. International Journal of Pharmaceutics, 392(1-2): 57-63. 

 

6．Zhong Z-M, Bai L, Chen J-T, 2009. Advanced Oxidation Protein Products Inhibit Proliferation and Differentiation of Rat Osteoblast-like Cells via NF-κB Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry, 24(1-2): 105-114.  

 

7． Chen Guozhu, Zhang Xuhui, Zhao Ming, Wang Yan, Cheng Xiang, Wang Di, Xu Yuanji, Du Zhiyan, Yu Xiaodan, 2011. Celastrol targets mitochondrial respiratory chain complex I to induce reactive oxygen species-dependent cytotoxicity in tumor cells. BMC Cancer, 11:170. doi:10.1186/1471-2407-11-170.  

 

8．Zhao Hong, Liu GuoLiang, Wang QiuYue, Ding LiYing, Cai Hui, Jiang HaiHong, Xin ZhongQiu, 2007. Effect of ghreli n on human endothelial cells apoptosis induced by high glucose. Biochemical and Biophysical Research Communications, 362(3): 677-681.