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上海動物組織原位雜交電話-上海動物組織原位雜交-思特進
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原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交,從而對特定核酸順序進行精0準確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。
原位雜交(in situ hybridization)將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交,稱為原位雜交。
使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細菌或其他真核細胞中的位置。
原位雜交技術基本原理
原位雜交技術的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列,將有放6射性或非放6射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對,結合成專一的核酸雜交分子,經一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。
為顯示特定的核酸序列必須具備3個重要條件:組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結合的標記物。
雜交技術zui重要的因素之一是選擇zui適的雜交反應溫度。若反應溫度低于Tm 10~15℃,堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩定的雙鏈,錯配對減少。若反應溫度再低(Tm-30℃),雖然互補鏈之間也可形成穩定的雙鏈,但互補堿基配對減少,錯配對增多、氫鍵結合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA,調整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍,因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗,即zui適復性溫度、苛刻復性溫度及非苛刻復性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見表18-3。
zui適復性溫度(Optimunm renaturation temperature, TOR):Tor =Tm –25℃
苛刻復性溫度:Ts = Tm – (10或15℃)
非苛刻復性溫度:Tns =Tm – (30或35℃)