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湖北熒光原位雜交制作-思特進-浙江熒光原位雜交電話
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原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交,從而對特定核酸順序進行精3確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。
原位雜交技術(In situ hybridization,ISH)是分子生物學、組織化學及細胞學相結合而產生的一門新興技術,始于20世紀60年代。
原位PCR;原位雜交細胞定位和PCR的高靈敏度相結合的技術,在細胞(爬片、甩片或涂片)或組織(石蠟、冰凍切片)上直接對靶基因片段進行擴增,通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法。
原位雜交技術應用于染色體、細胞和組織切片等樣品中進行核酸特異性檢測,與免6疫組化技術的結合應用,能將DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性與樣品的顯微拓撲信息結合起來。1969年Pardue和Gall將放9射性標記的探針直接應用于純化核酸的雜交,此后得益于分子克6隆技術的發展,及不同探針標記系統和檢測系統的應用,大大增加了原位雜交檢測的應用靈活性和檢測靈敏度。
雜交技術zui重要的因素之一是選擇zui適的雜交反應溫度。若反應溫度低于Tm 10~15℃,堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩定的雙鏈,錯配對減少。若反應溫度再低(Tm-30℃),雖然互補鏈之間也可形成穩定的雙鏈,但互補堿基配對減少,錯配對增多、氫鍵結合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA,調整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍,因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗,即zui適復性溫度、苛刻復性溫度及非苛刻復性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見表18-3。
zui適復性溫度(Optimunm renaturation temperature, TOR):Tor =Tm –25℃
苛刻復性溫度:Ts = Tm – (10或15℃)
非苛刻復性溫度:Tns =Tm – (30或35℃)