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固定相構造差異

裝填有多孔介質的色譜柱，固定相由多孔顆粒（porous particle）組成。如果把一個多孔顆粒看作是球形，那么球體表面會有許多孔，孔內部有眾多溶質分子的結合位點。顆粒的直徑稱為粒徑，孔的直徑稱為孔徑。顆粒之間的空間稱為空隙體積。Buffer溶液是無法流穿多孔顆粒介質內部的，他們永遠選擇顆粒間隙阻力最小的流路。

整體柱（monolith）由一整塊高度連通的管道組成，流體在均勻分布的管道里流動。整體柱基質由聚甲基丙烯酸酯組成，管道的平均大小是2um。在整體柱內部，每個管道與其他16個，甚至更多的管道連通。管道的高連通性有助于流體的均勻分布，減少運行壓力，實現(xiàn)高流速，低柱壓。整體柱整個管道的表面都可以用于結合溶質分子，從而造成固定相擁有很高的結合容量。

=多孔顆粒填充柱和整體柱

傳質方式差異

固定相介質構造差異造成色譜內流體模式和溶質傳質方式的差異，進而引起溶質分子結合效率和洗脫效率的差異。對于色譜的固定相來說，其動態(tài)結合容量（dynamic capacity）取決于生物分子的大小，可接觸到的表面積以及生物分子實現(xiàn)傳質的方式。

擴散和對流基本概念

生物分子從流動相移動到固定相的過程，稱為傳質（mass transport）。在流體中，實現(xiàn)溶質傳質的方式有2種，一種是擴散（diffusion），一種是對流（convection）。

擴散的驅動力是分子朝著隨機方向的熱運動，統(tǒng)計學上表現(xiàn)為順濃度梯度。當物質在空間中的分布存在濃度差時，濃度差就會引起擴散，最終隨著時間的推移，物質在空間上的分布更加均勻。

對流是由外力驅動的流體整體運動引起的質量傳遞，例如，液體水的流動會輸送水中溶解的分子或者離子。在色譜中，這種外力是由泵或者重力產生的壓力差，壓力差會引起介質整體的流動。

這些概念代表是色譜吸收基質的理想狀態(tài)，實際情況下，固定相配體和溶質之間的吸引作用或者排斥作用起 的主導作用。但是，了解溶質傳質的方式對于理解不同介質的性能是非常有必要的。

多孔介質中的擴散傳質

一個5000bp 的質粒DNA，其質量是3MDa，而巨無霸蛋白IgM的質量才只有960KD。在色譜環(huán)境中，核酸分子要表現(xiàn)得比相同質量的蛋白分子大很多。從統(tǒng)計學上講，生物分子在空間隨機翻轉，表現(xiàn)得更像是一個球體，其直徑等于最長構象。生物分子在流體中的直徑，并不直接和質量相關，而是取決于水合直徑（hydrodynamic diameter）。相同質量的分子，線性構象的分子要表現(xiàn)得比球狀構象的分子更大，例如線性質粒DNA，線性構象的RNA分子。也就是說，不管是單純從質量上來說，還是從水合直徑上來看，核酸都屬于超級大分子。

生物分子的大小是非常重要的，因為它決定著擴散速率。擴散是分子從高濃度區(qū)域向濃度低區(qū)域的隨機熱運動，非常緩慢，而且隨著分子變大，擴散會變得更慢。舉例說明，1.2kb RNA分子，其質量是400KD，分子大小是107nm，而IgG蛋白分子量是155KD，其分子大小是11.5nm。1.2kb RNA分子擴散系數(shù)要比IgG蛋白慢10倍多，打個比方，IgG從大拇指指甲蓋的中心擴散到最邊緣需要超過1年的時間，那么107nm RNA分子需要超過10年的時間。

在色譜中，固定相和流動相之間的距離非常小，納米級到微米級，但是對于依靠擴散的方式來實現(xiàn)生物分子傳質過程的多孔介質來說，這樣的距離是非常大的。在裝填多孔顆粒的色譜柱中，擴散是溶質分子進出顆?？讖絻炔康?方式（因為孔徑內部的流速為0），溶質分子越大，擴散就越慢，那么固定相多孔介質的動態(tài)結合容量就越低。

此外，在多孔顆粒色譜中，對流傳質和擴散傳質的相互作用也會造成固定相介質結合容量的降低。在對流將生物大分子沖走之前，它有一個非常短的時間擴散進入多孔顆粒內部。流速越快，窗口時間就會越短，溶質來不及擴散進入顆粒孔徑內部，就已經通過對流沖走了，因此顆粒的結合容量就會越低。由于生物大分子擴散系數(shù)降低引起的色譜固相介質結合容量的降低，可通過降低流速來彌補?？偨Y來說，在多孔顆粒介質中，固定相結合容量跟流速和溶質大小成反比。

整體柱中的對流傳質

固相介質孔徑和結合表面積差異

大分子物質，比如核酸，在整體柱中擁有更高的結合容量，這也同整體柱為生物大分子提供了一個更大的結合表面積有關。對于整體柱來說，內部管道的整個表面積都是可以被溶質分子結合的。

在多孔介質色譜柱中，溶質分子可以毫無障礙地接觸到顆粒外部全部的表面積，但是外部表面積只占到顆?？讖絻炔勘砻娣e的2%。只有更大的顆?？讖讲拍苋菁{更大的溶質分子，但是，溶質分子要毫無限制地結合到顆?？讖絻炔勘砻?，需要顆粒的平均孔徑超過溶質分子十倍之多。多孔介質的孔徑超過100nm是非常罕見的，因為孔徑過大會降低顆粒穩(wěn)定性。

1998年，有人用共聚焦顯微鏡觀察到質粒DNA主要吸附在顆粒的外表面,無法進入顆粒內部 。多孔介質對于蛋白來說，具有更高的結合能力，因為蛋白可以進入顆粒孔徑內部，占據(jù)孔徑內表面。在蛋白和核酸混合物中，這意味著蛋白會優(yōu)先占據(jù)顆?？讖絻炔靠臻g。盡管這樣會把顆粒外部大量的表面積留給核酸大分子，但不幸的是，顆粒外表面積只占據(jù)整個可結合表面積極其小的一部分，對于介質結合容量的改善微乎其微。

在整體柱中，不管大小，所有的溶質分子均有同等的機會結合到開放管道內表面上。這樣會造成占據(jù)單位表面積的小分子溶質結合質量遠遠小于占據(jù)相同表面積的大分子溶質結合質量。因此對于整體柱來說，大分子溶質會產生更高的結合容量。相反，多孔介質無法從這樣的關系中獲益，因為大分子低下的擴散系數(shù)會限制其實現(xiàn)單位表面積的飽和占據(jù)。

因此，從顆粒孔徑和介質單位面積的結合質量來看，整體柱更適合大分子溶質，因為其可以提供更高的介質結合容量。而對于小分子（蛋白）來說，多孔介質具有更高效的結合能力。

固相介質彌散差異

簡單來說彌散（dispersion）是由于流體速度差異造成的。當流體流過管道時，由于摩擦力的存在